TESIS DE MAESTRIA
Pro.In.Bio.
Facultad de Medicina
Universidad de la República
TITULO:
DESARROLLO DE UN PROTOCOLO DE CULTIVO CELULAR PARA LA OBTENCIÓN DE PROGENITORES DE CÉLULAS ENDOTELIALES:
EVALUACIÓN PRECLÍNICA
Dra. Susana Perdomo
Director de tesis: Prof. Agda. Dra. Cristina Touriño
Defensa: 30 de mayo 2018
Tribunal:
Prof. Dr. Alfonso Cayota
Prof. Dra. Milka Bengochea
Prof. Adj. Dra. Adriana Tiscornia
RESUMEN
Las enfermedades cardiovasculares son una de las causas más frecuentes de morbi-mortalidad en el mundo. Existe aún la necesidad de desarrollar nuevas estrategias para el tratamiento de la isquemia tisular. Las terapias de revascularización biológica, tales como terapia celular con células troncales/progenitoras derivadas de la médula ósea y/o sangre periférica, así como la terapia génica con factores de crecimiento endotelial, están siendo intensamente investigadas, como potenciales herramientas terapéuticas en enfermedades isquémicas. Estas han demostrado ser efectivas para promover neovascularización en modelos animales, así como factibles y seguras en el contexto de ensayos clínicos. Células de diferentes tipos y fuentes están siendo investigadas. Las células progenitoras endoteliales (CPE) desempeñan un papel importante en la neovascularización y en la reparación vascular, por lo cual las terapias celulares con CPE siguen siendo un enfoque novedoso y prometedor para el tratamiento de las enfermedades isquémicas. La sangre de cordón umbilical y placentaria (SCU) contiene un número significativo de CPE considerándose una fuente celular para aplicación clínica. Sin embargo, se requieren condiciones de cultivo celular libres de transmitir antígenos xenogénicos y potenciales zoonosis para su expansión ex vivo. Dado que las plaquetas tienen un papel fundamental en la regulación de la supervivencia celular pues contienen diversos factores de crecimiento, los productos derivados de plaquetas podrían desempeñar un papel importante en la expansión celular. El objetivo general de la maestría fue desarrollar un método de cultivo para obtener progenitores endoteliales y analizar si el suero rico en lisado de plaquetas (SRPL), obtenido de la misma unidad de SCU de la cual se obtienen células mononucleares, es adecuado para la expansión de CPE comparándolas con el cultivo con suero bovino fetal (SBF) bajo las mismas condiciones. Para ello, se recolectó SCU humana a partir del cordón umbilical después del alumbramiento de la placenta, previo consentimiento informado de la madre (n = 15). Las células mononucleares se obtuvieron por gradiente de densidad con Ficoll-Hypaque y se cultivaron en DMEM complementado con VEGF, SCF, IL-6 y Flt-3 en dos condiciones diferentes: 20% de suero bovino fetal (SBF) o 20% de SRPL-SCU autólogo de la misma unidad. Las células se cultivaron durante 15-49 días y se caracterizaron por citometría de flujo, técnicas de inmunofluorescencia y ensayos de tubulogénesis. La expansión celular se logró en ambos medios, siendo mayor con SRPL-SCU autólogo. Al final del cultivo, las células fueron similares tanto morfológicamente como inmunofenotípicamente: CD34+, CD45+/-, CD133-, CD31+, CD105+/-, CD14+, FvW+/-, VEGFR-2+. Durante el cultivo, las células perdieron algunos marcadores de CPE, mantuvieron bajos niveles de marcadores hematopoyéticos y adquirieron algunos marcadores de célula endotelial madura. El estudio de inmunofluorescencia confirmó la expresión de FvW, CD31 y VEGFR-2. Para el FvW los resultados fueron similares ya que se logró estudiar en ambas condiciones. La capacidad de formar túbulos fue no observado en las muestras analizadas. Concluimos que este método que utiliza SRPL-SCU permite la expansión celular con características inmunofenotípicas endoteliales. Aunque todavía no hay consenso sobre el fenotipo para definir CPE, las células obtenidas en estas condiciones podrían corresponden a las denominadas CPE de crecimiento temprano, que se cree son derivadas del linaje mielo-monocítico y participan en los procesos de regeneración vascular de forma parácrina. El SRPL-SCU autólogo podría ser un adecuado sustituto del SBF para expansión celular con el objetivo de aplicación clínica porque no agrega ningún riesgo inmunológico o infeccioso adicional al producto celular en sí. El papel para promover la angiogénesis de estas células cultivadas aún no se ha determinado. Estos resultados nos permiten plantear proyectos de investigación para optimizar la producción de SRPL-SCU, SRPL de sangre periférica, profundizar en la tipificación de CPE provenientes de MO y/o sangre periférica y desarrollar técnicas para promover la movilización y cosecha de CPE con fines terapéuticos.
